1前言

由致病疫霉引起的晚疫病是在世界范围内威胁马铃薯生产的最具破坏性的病害之一。病原体产生孢子囊，无性孢子通过风和雨传播。当落在叶子上的孢子囊直接发芽，或发展成游动孢子囊释放游动孢子，游动孢子囊化并发芽时，感染就开始了。此后，萌发的芽管发展成附着胞，渗透叶片角质层和表皮。感染通过菌丝的生长扩展到整个叶组织，导致水浸过的病变变黑。几天后，受感染的叶片组织坏死并开始孢子化。根据环境条件的不同，未受保护的马铃薯田可以在10天内被摧毁。

马铃薯晚疫病的抗病育种工作一直依赖于利用可杂交亲缘的显性抗病基因培育抗病品种。然而由于病原菌的进化，由抗病基因介导的抗性并不总是持久的。另一种获得抗病性的方法是沉默植物易感基因(S基因)，这一概念在十年前就被提出并用于开发新的育种策略来控制多种作物病害。近年来，该课题组利用候选沉默的稳定表达株系进行晚疫病抗病鉴定，发现感病基因StDND1、StDMR1和StDMR6的沉默可以提高马铃薯对晚疫病的抗性，但是对于这三个感病基因沉默后是如何抑制致病疫霉的侵染尚不清楚。

为了分析这些s基因沉默的植物如何启动防御反应以阻止侵染，该研究通过组织化学染色结合基因表达分析对StDND1、StDMR1和StDMR6基因单独沉默马铃薯株系的致病疫霉的侵染过程进行了跟踪。结果表明了不同的防御机制参与了马铃薯不同感病基因功能缺失介导的晚疫病抗性。

2材料方法

2.1病原体生长及接种物制备

致病疫霉菌株置于黑麦蔗糖琼脂培养基上在黑暗15℃条件下培养10-14天。用冷水(4℃)浸没布满孢菌丝的琼脂平板。收集孢子悬液，在4℃下孵育1-2小时，诱导游动孢子释放。用15μm尼龙网过滤，分离出游动孢子。

2.2植物生长条件和侵染试验

将三周大的离体培养马铃薯幼苗移栽到土壤中，在温度为25±2℃，75%的相对湿度和16/8小时(光/暗)光周期的温室中生长。成熟的马铃薯植株具有充分发育的复合叶片，用于离体叶片测定。收获的叶子装在泡沫塑料中，放入有透明盖子的塑料盒中。在叶片背面接种10μl滴状接种物(2.5×游动孢子/ml)，然后在18℃下孵育16/8小时的光周期。病变直径用3-7dpi的数字显示卡尺测量。病害试验重复两次，每一株都有30个接种点。

2.3镜检和组织化学染色

通过从点接种的叶片区域穿孔出的成像叶盘(直径10毫米)来评估感染程度。为优化染色，将叶盘置于染色液中过夜。用96%乙醇煮沸叶盘，清除组织。随后将叶片保存在70%乙醇中，直到检测。组织化学GUS染色后进行荧光显微镜观察。在每个时间点，每个马铃薯基因型至少观察到8个叶盘。除组织化学GUS检测外，每次生物检测至少进行两次。

3结果

3.1StDND1,StDMR1和StDMR6的沉默植株对多种致病疫霉的抗性增强

在StDND1沉默的情况下，分离到Pic、USA和EC1三个遗传多样性菌株。在该研究中，测试了三个s基因沉默的马铃薯系与多个致病疫霉分离株。通过qRT-PCR定量分析s基因表达的减少(图1a)，通过两个独立实验测量接种后3-7天的病变大小(dpi)，在离体叶片分析中评估抗性。敏感对照cv在7dpi处形成孢子状病变(图1b)，而s基因沉默植物的病变发展受到了很大的阻碍，StDND1和StDMR6沉默的植株接种Pic后均未出现病变生长，接种侵袭性菌株USA和EC1后，病变明显小于cv。在StDMR1和StDMR6沉默的植株上，在6dpi时，可以看到接种位点周围的黑色坏死斑点，而stdnd1沉默的植株则没有这种反应(图2a)。综上，沉默StDND1，StDMR1和StDMR6能提高对多个致病疫霉的抗性。

3.2StDND1,StDMR1和StDMR6的沉默植株阻碍了致病疫霉的感染

分别利用带有GUS和GFP标签的致病疫霉侵染StDND1、StDMR1和StDMR6基因单独沉默马铃薯株系，显微分析表明，在StDND1沉默的马铃薯叶片上，致病疫霉孢子的渗透受到了阻碍。

StDMR6沉默植株感染部位下方的叶组织在12hpi时开始变黄。从24小时以后，在cv的叶片中观察到了细胞内菌丝而在StDMR1和StDMR6沉默的植物上，发现了带有短萌发管和细胞间菌丝的囊肿。不过StDND1的沉默植株在任何时间点都未观察到感染。

3.3致病疫霉的接种影响StDMR1和StDMR6沉默的马铃薯叶片的ROS积累

为了进一步确定不同互作阶段，研究了致病疫霉对叶片活性氧积累的影响。使用3,3二氨基联苯胺(DAB)和硝基蓝四唑(NBT)染色，分别监测过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子(O2?)的生成。在StDMR1-和stdmr6沉默的植株上，从6hpi开始观察到H2O2和O2?的积累。在对照植株上，分别从12hpi和24hpi开始产生O2?和H2O2。在stdnd1沉默的植株中，没有H2O2和O2?的积累。

3.4s基因沉默植物中防御相关基因表达的变化

在StDND1沉默的植物中，抗性发生似乎并不依赖于细胞死亡反应，因为发现在大多数接种位点并没有发现ROS的积累。激素途径的标记基因的表达分析表明，在StDND1和StDMR6沉默的植物中观察到的抗性增加依赖于水杨酸和乙烯介导的信号通路的早期启动。StDMR1沉默介导的抗病与SA介导信号的早期诱导相关。

数据表明，在StDMR1沉默的植物中，只有sa介导的信号通路有助于增加对致病疫霉的抗性。而在StDND1和StDMR6沉默的植物中，ET介导的信号也可能起到作用。为了进一步验证在接种StDMR1和StDMR6沉默的植物中观察到的氧化破裂和细胞死亡反应，此外还评估了与这些事件相关的标记基因的表达，包括3个编码ros清除或生成酶的基因，即超氧化物歧化酶(StSOD2)、抗坏血酸过氧化物酶(StAPX2)和过氧化氢酶(StCAT1)，以及2个细胞死亡相关基因，即StHSR3和StATG8I。从6hpi开始，在cv对照中，StDMR1和StDMR6沉默的植株中，这些基因的诱导表达量略高。相比之下，这些标记基因在StDND1沉默的植物中几乎检测不到表达，因此，这些表达模式与在各自的RNAi植物中观察到的ROS积累相匹配。

结论

研究表明，通过沉默马铃薯的StDND1、StDMR1或StDMR6，可以有效地实现对马铃薯马铃薯疫霉菌的广谱抗性。该研究利用GUS(β-葡萄糖苷酶)和GFP(绿色荧光蛋白)对致病疫霉进行标记。在stdnd1沉默的植株上，囊萌发后，致病疫霉的渗透受阻，生长受阻。在StDMR1和StDMR6沉默的植株上，致病疫霉在芽管出现后，侵染菌受到阻碍，这与细胞死亡和ROS在接种部位的积累有关。研究结果结合以往的报道表明，不同作物中感病基因的功能缺失可能导致对多种病原体的广谱抗性。由于感病基因在不同作物间的高度保守性，这种方法还可以应用到其它作物中，为作物抗病育种提供新的抗病资源。因此，合理利用感病基因在改善植物抗性方面具有重大的潜力和应用前景。不过，对于不同植物中s基因功能缺失突变介导的抗性的分子基础还需要进一步的研究。